臨床(chuang)基因擴(kuo)(kuo)增(zeng)實驗(yan)(yan)又稱 PCR實驗(yan)(yan)，是專門(men)用(yong)來(lai)檢(jian)(jian)(jian)驗(yan)(yan)艾滋(zi)病(bing)(bing)(bing)、乙型肝炎、禽疫病(bing)(bing)(bing)等病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)感染性(xing)(xing)疾病(bing)(bing)(bing)的(de)(de)一種檢(jian)(jian)(jian)測(ce)手段。它可以(yi)通過將病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)體(ti)內(nei)所含的(de)(de)基因進行(xing)(xing)擴(kuo)(kuo)增(zeng)的(de)(de)方(fang)法(fa)，測(ce)出(chu)(chu)一些病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)含量不高的(de)(de)感染者(zhe)體(ti)內(nei)是否含有特定(ding)的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)。由于該檢(jian)(jian)(jian)測(ce)方(fang)法(fa)可以(yi)測(ce)出(chu)(chu)普通檢(jian)(jian)(jian)驗(yan)(yan)難以(yi)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)出(chu)(chu)的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)并具(ju)有靈敏度高、特異性(xing)(xing)高、快(kuai)捷、對(dui)樣(yang)品(pin)要(yao)求低等優點，因此被臨床(chuang)醫(yi)生廣為認可，已廣泛應用(yong)于醫(yi)院的(de)(de)臨床(chuang)診(zhen)斷和(he)各防疫檢(jian)(jian)(jian)測(ce)部門(men)的(de)(de)禽疫病(bing)(bing)(bing)診(zhen)斷。但是，這(zhe)種實驗(yan)(yan)需要(yao)有能保證安全、配(pei)置合理(li)的(de)(de)實驗(yan)(yan)室和(he)非常(chang)規范(fan)的(de)(de)操作(zuo)為前提。近年來(lai)對(dui)臨床(chuang)基因擴(kuo)(kuo)增(zeng)檢(jian)(jian)(jian)驗(yan)(yan)實驗(yan)(yan)室的(de)(de)建設(she)(she)越(yue)來(lai)越(yue)得(de)到重(zhong)視，因為它對(dui)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)結果的(de)(de)可靠性(xing)(xing)、準確性(xing)(xing)和(he)安全性(xing)(xing)起到至關重(zhong)要(yao)的(de)(de)作(zuo)用(yong)。本(ben)文主(zhu)要(yao)從臨床(chuang)基因擴(kuo)(kuo)增(zeng)檢(jian)(jian)(jian)驗(yan)(yan)實驗(yan)(yan)室的(de)(de)平面(mian)布局，空調通風系統設(she)(she)計(ji)、氣流控制和(he)污染的(de)(de)防制幾(ji)個方(fang)面(mian)對(dui)實驗(yan)(yan)室設(she)(she)計(ji)中的(de)(de)主(zhu)要(yao)特點進行(xing)(xing)了闡述(shu)。

臨(lin)床基因(yin)擴增(zeng)檢驗實驗室(shi)設(she)計的(de)核心問(wen)題(ti)是如何避免污染。因(yin)此，實驗室(shi)的(de)平(ping)面布局、空調通風(feng) 系統設(she)計、氣流(liu)控制等都是圍繞這(zhe)個(ge)(ge)核心問(wen)題(ti)進(jin)行的(de)。下面就對這(zhe)幾個(ge)(ge)方(fang)面分(fen)別進(jin)說明。

二、 PCR實驗室平面(mian)布局

臨床基因擴增(zeng)檢(jian)驗實驗室原則上分(fen)(fen)為四個單獨的(de)工作區(qu)(qu)域：試劑(ji)貯存(cun)和(he)(he)準備(bei)(bei)區(qu)(qu)、標(biao)本制(zhi)備(bei)(bei)區(qu)(qu)、擴增(zeng)反(fan)應混合物配(pei)制(zhi)和(he)(he)擴增(zeng)區(qu)(qu)、擴增(zeng)產(chan)物分(fen)(fen)析區(qu)(qu)。為避免(mian)交叉污染，進入各(ge)個工作區(qu)(qu)域必須嚴格(ge)遵(zun)循單一方向(xiang)進行，即只能從試劑(ji)貯存(cun)和(he)(he)準備(bei)(bei)區(qu)(qu)→標(biao)本制(zhi)備(bei)(bei)區(qu)(qu)→擴增(zeng)反(fan)應混合物配(pei)制(zhi)和(he)(he)擴增(zeng)區(qu)(qu)→擴增(zeng)產(chan)物分(fen)(fen)析區(qu)(qu)。

各實驗(yan)區之間的試劑及(ji)樣品傳(chuan)遞(di)應(ying)通(tong)過傳(chuan)遞(di)窗進行。

三、實(shi)驗(yan)室空調通風系統設計及(ji)壓力控制

PCR實(shi)驗(yan)(yan)室并沒(mei)有嚴(yan)格的凈化要求，但(dan)是為避(bi)免(mian)各(ge)個實(shi)驗(yan)(yan)區(qu)域間(jian)交叉(cha)污染的可能(neng)性，宜采用全送全排(pai)的氣流組織形式。同時，要嚴(yan)格控制(zhi)送、排(pai)風的比例以(yi)保證各(ge)實(shi)驗(yan)(yan)區(qu)的壓力要求。

1、試劑貯存和準(zhun)備區

該實驗(yan)區(qu)主要進行的(de)操作(zuo)為(wei)貯存試劑(ji)的(de)制(zhi)(zhi)(zhi)備、試劑(ji)的(de)分裝和主反應混合(he)液的(de)制(zhi)(zhi)(zhi)備。試劑(ji)和用于標本(ben)制(zhi)(zhi)(zhi)作(zuo)的(de)材(cai)料(liao)應直(zhi)接運送至該區(qu)，不得經(jing)過其(qi)他(ta)區(qu)域。試劑(ji)原材(cai)料(liao)必須貯存在本(ben)區(qu)內，并(bing)在本(ben)區(qu)內制(zhi)(zhi)(zhi)備成(cheng)所需的(de)貯存試劑(ji)。

對(dui)與(yu)氣流壓(ya)力的控制(zhi)，本區并沒有(you)嚴格的要求。

2、標本制備區

該(gai)區域主要(yao)進行的(de)操作(zuo)為臨床標本的(de)保存、核酸(RNA、DNA)提取(qu)、貯存及其加入至(zhi)擴增反應管和測定RNA時cDNA的(de)合成。

本區的壓力梯度要求為(wei)：相對于(yu)鄰(lin)近(jin)區域為(wei)正壓，以避免從鄰(lin)近(jin)區進入本區的氣溶(rong)(rong)膠(jiao)(jiao)污染。另(ling)外(wai)，由于(yu)在(zai)加樣操作(zuo)中可能會發生氣溶(rong)(rong)膠(jiao)(jiao)所(suo)致的污染，所(suo)以應避免在(zai)本區內不(bu)必要的走動。

3、擴(kuo)增反(fan)應混合(he)物配制(zhi)和擴(kuo)增區

該(gai)區(qu)(qu)域(yu)主(zhu)要(yao)進行的(de)(de)操作為DNA或 cDNA擴增。此外，已制(zhi)備的(de)(de)DNA模板和(he)合成(cheng)的(de)(de) cDNA(來自樣(yang)本(ben)制(zhi)備區(qu)(qu)) 的(de)(de)加入和(he)主(zhu)反(fan)應(ying)混合液(ye)(來自試劑(ji)貯存和(he)制(zhi)備區(qu)(qu)) 制(zhi)備成(cheng)反(fan)應(ying)混合液(ye)等(deng)也(ye)可在(zai)本(ben)區(qu)(qu)內進行。在(zai)巢式(shi) PCR測(ce)定中，通常在(zai)一輪擴增后必(bi)須打開反(fan)應(ying)管，因此巢式(shi)擴增有較高的(de)(de)污染(ran)危險性，第二次(ci)加樣(yang)必(bi)須在(zai)本(ben)區(qu)(qu)內進行。

本(ben)區(qu)的(de)(de)壓力梯度要求為：相對(dui)于鄰近區(qu)域為負(fu)壓，以避免氣(qi)溶膠從本(ben)區(qu)漏出。為避免氣(qi)溶膠所(suo)致的(de)(de)污(wu)染，應盡量減少在本(ben)區(qu)內的(de)(de)不(bu)必(bi)要的(de)(de)走動。個(ge)別(bie)操作如加(jia)樣等應在超凈臺內進行。

4、擴增產物分析區

該區域主要進行的操作為擴增片段的測定(ding)。如使(shi)用全自動封(feng)閉分析儀器檢測，此區域可不設。

本區(qu)(qu)(qu)是最主要的(de)(de)擴(kuo)增產物污(wu)染來源，因此對本區(qu)(qu)(qu)的(de)(de)壓(ya)力(li)梯度的(de)(de)要求為(wei)：相(xiang)對于(yu)鄰近(jin)區(qu)(qu)(qu)域(yu)為(wei)負壓(ya)，以避免(mian)擴(kuo)增產物從本區(qu)(qu)(qu)擴(kuo)散至其它區(qu)(qu)(qu)域(yu)。

四(si)、污染的預防與控制

PCR實驗室設(she)計的核(he)心問題(ti)是如何避免(mian)污(wu)染。在實際工作中，常見的有以(yi)下幾種污(wu)染類型：擴增產物的污(wu)染；天(tian)然(ran)基因組DNA的(de)污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)；試劑的(de)污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)以及標(biao)本間的(de)污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)。由于一旦發(fa)生(sheng)污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)，實驗就必須(xu)停止，直到找到污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)源為止，而且(qie)實驗結果必須(xu)作廢，需重新進行(xing)實驗。所以發(fa)生(sheng)污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)后再圍繞實驗室(shi)來尋找污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)源不但耗時而且(qie)繁(fan)瑣，浪(lang)費(fei)人(ren)力物力。因(yin)此要避(bi)免污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)，首先(xian)應是(shi)預防(fang)，而不是(shi)排(pai)除。

1、工作區域的嚴(yan)格劃分(fen)

（1）各個(ge)實驗區域設(she)置(zhi)合理(li)；

（2）各個(ge)(ge)實驗(yan)區域要有明顯(xian)的標記（如(ru)醒(xing)目的門牌(pai)或不同的地(di)面(mian)顏(yan)色等(deng)），以避免各個(ge)(ge)不同實驗(yan)區域設(she)備物品、試劑等(deng)發生混淆。

2、合理的系統設置

（1）合理的(de)(de)空(kong)調通風系(xi)統設置，盡(jin)量采用全送(song)全排(pai)的(de)(de)空(kong)調系(xi)統；

（2）嚴格的(de)氣流壓(ya)力(li)控(kong)制，保證不同的(de)實驗區內不同的(de)壓(ya)力(li)要求。

3、規范的操作

（1）臨床基因擴增(zeng)檢驗實驗室(shi)的(de)技術人員必須進(jin)行上崗培訓，經培訓合格后才能從事臨床基因擴增(zeng)檢驗的(de)工作(zuo)；

（2）在實驗操作過程(cheng)中，操作者必須戴手(shou)套，并經常更換。此外(wai)，操作中使用一(yi)次性帽子也是一(yi)個(ge)有效地防止污染的措施(shi)；

（3）清潔工作(zuo)及時、正確。實驗(yan)工作(zuo)結束(shu)后，必須立即對本區進(jin)行(xing)清潔。除常(chang)規的(de)消(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)毒(du)(du)液體對表(biao)面(mian)進(jin)行(xing)擦拭消(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)毒(du)(du)或紫外線燈的(de)照射(she)消(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)毒(du)(du)外，對一些實驗(yan)設備(bei)還應進(jin)行(xing)高壓消(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)毒(du)(du)處理。

4、嚴格的管理

（1）嚴格(ge)控制進出實(shi)(shi)驗室的(de)人員(yuan)。與實(shi)(shi)驗無關的(de)人員(yuan)不得隨意進出實(shi)(shi)驗室，有條件的(de)情(qing)況下要設(she)置獨立(li)的(de)通(tong)道和(he)進出整個(ge)實(shi)(shi)驗區的(de)門；

（2）在(zai)各個實驗區(qu)域使(shi)用帶有明顯區(qu)別標志的工(gong)作服（如不(bu)同顏色），當工(gong)作人員離開(kai)時(shi)不(bu)得將本區(qu)的工(gong)作服帶至其(qi)它(ta)區(qu)域；

（3）盡量(liang)減少在實驗(yan)區內不必要的(de)走動以(yi)減少交叉(cha)污(wu)染(ran)的(de)可(ke)能性。

（4）擴增(zeng)(zeng)產(chan)(chan)物分析區是最(zui)主要的(de)擴增(zeng)(zeng)產(chan)(chan)物污染來源，廢液不能在(zai)實(shi)驗室(shi)中傾倒，必(bi)須經消毒(du)(du)液浸(jin)泡消毒(du)(du)后在(zai)遠離實(shi)驗室(shi)的(de)地方棄掉，用(yong)過的(de)吸頭等(deng)一(yi)次性(xing)材料也應經消毒(du)(du)液浸(jin)泡消毒(du)(du)后統(tong)一(yi)處理，如焚燒等(deng)；

（5）擴增(zeng)產(chan)物分析區可能會用到(dao)某些可致(zhi)基因突變和(he)有毒物質，應(ying)特別注意(yi)實驗人員的安全防護。

5、完備的實驗室配套設施

完備的實驗室配套設(she)施是(shi)保(bao)證(zheng)實驗工作(zuo)的必要(yao)條件，應(ying)根據各(ge)個實驗室實驗內容的不同配備相(xiang)應(ying)的設(she)備和儀器，如超凈(jing)工作(zuo)臺(tai)、離心機、加樣(yang)器等。