臨床(chuang)基(ji)因(yin)擴(kuo)增(zeng)實(shi)驗又稱 PCR實(shi)驗，是(shi)(shi)專門用(yong)來檢(jian)(jian)(jian)驗艾滋病(bing)(bing)、乙型(xing)肝(gan)炎、禽疫病(bing)(bing)等病(bing)(bing)毒(du)感染(ran)性疾病(bing)(bing)的(de)(de)(de)(de)一種檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)手段。它(ta)可以(yi)通(tong)過將(jiang)病(bing)(bing)毒(du)體內(nei)所含的(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)進行擴(kuo)增(zeng)的(de)(de)(de)(de)方法(fa)，測(ce)(ce)出一些病(bing)(bing)毒(du)含量不高的(de)(de)(de)(de)感染(ran)者體內(nei)是(shi)(shi)否含有(you)特(te)定的(de)(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒(du)。由于該檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)方法(fa)可以(yi)測(ce)(ce)出普通(tong)檢(jian)(jian)(jian)驗難(nan)以(yi)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)出的(de)(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒(du)并具有(you)靈敏度高、特(te)異性高、快(kuai)捷、對(dui)(dui)樣品要(yao)求低等優點(dian)，因(yin)此被(bei)臨床(chuang)醫生廣為(wei)認可，已廣泛應用(yong)于醫院的(de)(de)(de)(de)臨床(chuang)診(zhen)斷(duan)和各防疫檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)部門的(de)(de)(de)(de)禽疫病(bing)(bing)診(zhen)斷(duan)。但是(shi)(shi)，這種實(shi)驗需要(yao)有(you)能保證安(an)全、配(pei)置合理的(de)(de)(de)(de)實(shi)驗室(shi)和非常規范的(de)(de)(de)(de)操作為(wei)前提。近(jin)年來對(dui)(dui)臨床(chuang)基(ji)因(yin)擴(kuo)增(zeng)檢(jian)(jian)(jian)驗實(shi)驗室(shi)的(de)(de)(de)(de)建設越來越得(de)到重視，因(yin)為(wei)它(ta)對(dui)(dui)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)結果(guo)的(de)(de)(de)(de)可靠性、準(zhun)確性和安(an)全性起到至關重要(yao)的(de)(de)(de)(de)作用(yong)。本文主要(yao)從(cong)臨床(chuang)基(ji)因(yin)擴(kuo)增(zeng)檢(jian)(jian)(jian)驗實(shi)驗室(shi)的(de)(de)(de)(de)平面布局，空調通(tong)風系統設計、氣流控(kong)制(zhi)和污染(ran)的(de)(de)(de)(de)防制(zhi)幾個方面對(dui)(dui)實(shi)驗室(shi)設計中的(de)(de)(de)(de)主要(yao)特(te)點(dian)進行了闡述。

臨床基因(yin)擴增檢(jian)驗(yan)實驗(yan)室(shi)設(she)計的核心問題是如何(he)避免(mian)污染。因(yin)此，實驗(yan)室(shi)的平面(mian)布局、空調通風 系統設(she)計、氣流控制等都是圍繞這個核心問題進(jin)行(xing)的。下(xia)面(mian)就對這幾個方面(mian)分別進(jin)說明。

二、 PCR實驗(yan)室(shi)平(ping)面布(bu)局

臨床基因擴(kuo)增(zeng)檢驗(yan)實驗(yan)室(shi)原則上分(fen)為(wei)四(si)個單獨的(de)工(gong)作區(qu)域：試劑(ji)貯存(cun)(cun)和準(zhun)備(bei)(bei)區(qu)、標本制(zhi)備(bei)(bei)區(qu)、擴(kuo)增(zeng)反應(ying)混合物(wu)配(pei)(pei)制(zhi)和擴(kuo)增(zeng)區(qu)、擴(kuo)增(zeng)產物(wu)分(fen)析(xi)區(qu)。為(wei)避免交叉(cha)污染，進入各個工(gong)作區(qu)域必須嚴格遵循單一方向進行(xing)，即只能從試劑(ji)貯存(cun)(cun)和準(zhun)備(bei)(bei)區(qu)→標本制(zhi)備(bei)(bei)區(qu)→擴(kuo)增(zeng)反應(ying)混合物(wu)配(pei)(pei)制(zhi)和擴(kuo)增(zeng)區(qu)→擴(kuo)增(zeng)產物(wu)分(fen)析(xi)區(qu)。

各實驗區之(zhi)間(jian)的(de)試劑(ji)及樣品傳(chuan)(chuan)遞應通(tong)過傳(chuan)(chuan)遞窗(chuang)進行。

三、實驗(yan)室空調通風系統設計(ji)及壓力控(kong)制

PCR實驗(yan)室(shi)并沒(mei)有嚴格的(de)(de)(de)凈化要求(qiu)，但是為避免各個實驗(yan)區(qu)域(yu)間(jian)交叉(cha)污(wu)染的(de)(de)(de)可(ke)能性，宜采用全送全排的(de)(de)(de)氣流組織(zhi)形式。同(tong)時，要嚴格控制送、排風的(de)(de)(de)比(bi)例以保證各實驗(yan)區(qu)的(de)(de)(de)壓力要求(qiu)。

1、試(shi)劑貯(zhu)存和(he)準備區

該(gai)實(shi)驗區(qu)(qu)主(zhu)要進行(xing)的(de)操作為(wei)貯存試(shi)劑(ji)的(de)制(zhi)備、試(shi)劑(ji)的(de)分裝(zhuang)和主(zhu)反應(ying)混合(he)液(ye)的(de)制(zhi)備。試(shi)劑(ji)和用于標本制(zhi)作的(de)材料(liao)應(ying)直接運送(song)至該(gai)區(qu)(qu)，不得(de)經過其(qi)他區(qu)(qu)域。試(shi)劑(ji)原(yuan)材料(liao)必須(xu)貯存在本區(qu)(qu)內，并在本區(qu)(qu)內制(zhi)備成(cheng)所(suo)需的(de)貯存試(shi)劑(ji)。

對與氣流壓力的控制，本(ben)區并沒有嚴格的要(yao)求。

2、標本制備區

該區(qu)域主要進行的(de)操作為臨床(chuang)標本的(de)保存(cun)、核(he)酸(RNA、DNA)提取、貯存(cun)及其加入至擴增反(fan)應(ying)管和測定(ding)RNA時cDNA的(de)合(he)成。

本(ben)區(qu)的(de)壓力梯(ti)度要(yao)求為：相(xiang)對于(yu)鄰近區(qu)域為正壓，以(yi)避(bi)免從(cong)鄰近區(qu)進入本(ben)區(qu)的(de)氣(qi)溶(rong)膠(jiao)(jiao)污(wu)染(ran)。另外，由于(yu)在加樣操作中可能會(hui)發生氣(qi)溶(rong)膠(jiao)(jiao)所致(zhi)的(de)污(wu)染(ran)，所以(yi)應避(bi)免在本(ben)區(qu)內不必要(yao)的(de)走動。

3、擴增(zeng)反應混合(he)物配制和擴增(zeng)區

該區域主要進(jin)行(xing)(xing)的操作為DNA或 cDNA擴增(zeng)。此外(wai)，已(yi)制備的DNA模(mo)板和(he)合(he)成的 cDNA(來(lai)自(zi)樣(yang)本(ben)制備區) 的加入和(he)主反(fan)應(ying)混合(he)液(來(lai)自(zi)試劑貯(zhu)存和(he)制備區) 制備成反(fan)應(ying)混合(he)液等(deng)也可在本(ben)區內進(jin)行(xing)(xing)。在巢(chao)式 PCR測定中，通常在一輪擴增(zeng)后必須打開(kai)反(fan)應(ying)管，因(yin)此巢(chao)式擴增(zeng)有較高的污染危險性，第(di)二次加樣(yang)必須在本(ben)區內進(jin)行(xing)(xing)。

本(ben)區(qu)(qu)的(de)壓(ya)力(li)梯度要求(qiu)為(wei)：相(xiang)對于鄰近區(qu)(qu)域為(wei)負壓(ya)，以避免氣溶(rong)膠從本(ben)區(qu)(qu)漏(lou)出。為(wei)避免氣溶(rong)膠所(suo)致的(de)污染(ran)，應盡量減少(shao)在本(ben)區(qu)(qu)內的(de)不(bu)必要的(de)走動。個別操作如加樣等應在超凈(jing)臺內進行。

4、擴增產物分析區

該(gai)區(qu)域主要進行的操作(zuo)為(wei)擴(kuo)增片段的測(ce)定。如使用全自(zi)動封閉分析(xi)儀器檢測(ce)，此區(qu)域可不(bu)設。

本(ben)區(qu)(qu)是最主(zhu)要的擴(kuo)增產物(wu)污染來源，因此對(dui)本(ben)區(qu)(qu)的壓力梯度的要求為(wei)：相對(dui)于(yu)鄰近區(qu)(qu)域為(wei)負(fu)壓，以避(bi)免擴(kuo)增產物(wu)從本(ben)區(qu)(qu)擴(kuo)散(san)至其它(ta)區(qu)(qu)域。

四、污(wu)染(ran)的預防與控制

PCR實驗室設計的(de)核(he)心問題(ti)是如何避(bi)免污(wu)染(ran)(ran)。在實際工作中(zhong)，常見的(de)有(you)以下幾種污(wu)染(ran)(ran)類型(xing)：擴增產物的(de)污(wu)染(ran)(ran)；天然基(ji)因(yin)組DNA的污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)；試劑的污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)以及標本間的污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)。由(you)于(yu)一旦(dan)發生污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)，實驗(yan)就(jiu)必須(xu)(xu)停(ting)止，直到找到污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)源(yuan)為(wei)止，而且實驗(yan)結果必須(xu)(xu)作(zuo)廢，需重新進行實驗(yan)。所以發生污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)后再圍繞實驗(yan)室來尋找污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)源(yuan)不但耗時而且繁瑣，浪費人力(li)物(wu)力(li)。因此要(yao)避免污(wu)(wu)(wu)(wu)染(ran)，首先應是(shi)預(yu)防，而不是(shi)排除(chu)。

1、工作區域的嚴格(ge)劃分

（1）各(ge)個實驗區域設置合理；

（2）各(ge)個(ge)實(shi)驗(yan)區(qu)域(yu)(yu)要有明顯的(de)標(biao)記（如醒目的(de)門牌或不(bu)同的(de)地面顏色等(deng)），以避免各(ge)個(ge)不(bu)同實(shi)驗(yan)區(qu)域(yu)(yu)設備物品、試劑等(deng)發生(sheng)混淆。

2、合理的系統(tong)設置

（1）合理的空調(diao)通風(feng)系統(tong)設置，盡量采用全(quan)送全(quan)排的空調(diao)系統(tong)；

（2）嚴格的氣流壓(ya)力控制，保證不同(tong)的實(shi)驗(yan)區(qu)內不同(tong)的壓(ya)力要求。

3、規(gui)范的操(cao)作

（1）臨(lin)(lin)床(chuang)(chuang)基因擴增檢(jian)驗(yan)實驗(yan)室(shi)的技術人員(yuan)必(bi)須進行上崗培(pei)訓(xun)，經培(pei)訓(xun)合格后才(cai)能從(cong)事臨(lin)(lin)床(chuang)(chuang)基因擴增檢(jian)驗(yan)的工作；

（2）在實驗操(cao)作過(guo)程中，操(cao)作者(zhe)必須(xu)戴(dai)手套，并經常(chang)更換。此外，操(cao)作中使(shi)用一次性(xing)帽子也是一個(ge)有(you)效(xiao)地(di)防止(zhi)污染的措施(shi)；

（3）清潔工(gong)作(zuo)及時、正確。實驗工(gong)作(zuo)結(jie)束后，必須立即(ji)對本區(qu)進(jin)(jin)行清潔。除常規的消毒液體對表(biao)面進(jin)(jin)行擦(ca)拭(shi)消毒或紫(zi)外線燈的照射消毒外，對一些(xie)實驗設備(bei)還應(ying)進(jin)(jin)行高壓(ya)消毒處理(li)。

4、嚴格的管理

（1）嚴格控制(zhi)進出(chu)(chu)實(shi)驗室的(de)人員(yuan)。與實(shi)驗無關的(de)人員(yuan)不得隨意進出(chu)(chu)實(shi)驗室，有條件的(de)情(qing)況下要設置(zhi)獨立的(de)通道和進出(chu)(chu)整個(ge)實(shi)驗區的(de)門；

（2）在各個實驗區域使用(yong)帶(dai)有明(ming)顯區別標志的工(gong)作服（如不同顏色），當工(gong)作人員離開時不得將本(ben)區的工(gong)作服帶(dai)至(zhi)其它區域；

（3）盡量減少(shao)在(zai)實(shi)驗區內不必要(yao)的(de)走動以減少(shao)交叉污染(ran)的(de)可能性。

（4）擴增產物分析(xi)區(qu)是最主要的擴增產物污染來(lai)源(yuan)，廢液(ye)不(bu)能在(zai)實驗(yan)室中傾倒，必須經消毒液(ye)浸(jin)泡(pao)消毒后(hou)(hou)在(zai)遠離實驗(yan)室的地方棄(qi)掉，用過的吸頭(tou)等(deng)一(yi)次(ci)性材料也應經消毒液(ye)浸(jin)泡(pao)消毒后(hou)(hou)統一(yi)處理(li)，如焚燒等(deng)；

（5）擴增產物分(fen)析區(qu)可能會用到某些可致基因(yin)突變(bian)和有毒物質，應特別注意實驗人員的安全防(fang)護。

5、完(wan)備的(de)實驗室配套設施(shi)

完備的實驗(yan)(yan)室(shi)配(pei)套設(she)施是保證(zheng)實驗(yan)(yan)工(gong)作的必要(yao)條(tiao)件，應根(gen)據各個實驗(yan)(yan)室(shi)實驗(yan)(yan)內容的不同配(pei)備相(xiang)應的設(she)備和(he)儀器，如超(chao)凈工(gong)作臺、離心機(ji)、加樣器等(deng)。